Потребностью клетки в некотором веществе можно считать его содержание в единице биомассы или в одной клетке. Эту величину называют также внутриклеточной концентрацией вещества, или клеточной квотой (Droop, 1973). Роль потребности также играет “экономический коэффициент” — количество субстрата, необходимое для наращивания единицы клеточной биомассы.

В дальнейшем предлагается (Левич и др., 1986б; Левич, Булгаков, 1997) называть потребностями величины, входящие в балансовые уравнения . Эти величины есть количества k-го субстрата, перешедшего из среды в единицу биомассы популяции вида i (DL^k — количество k-го субстрата, потребленное всем сообществом, b_i — биомасса популяции вида i). Величина , как правило, не совпадает с содержанием вещества в биомассе, потому что потребленный из среды биогенный элемент не только депонируется в клетках, но и выводится (в иных химических формах) из организма, а также частично теряется с клеточной массой при разрывах клеточных оболочек в процессе деления.

Таким образом, коэффициенты близки к клеточным квотам, если можно пренебречь выделением вещества из клеток. Величины , близкие по смыслу к экономическому коэффициенту, предлагается называть потребностями фитопланктона в субстратных факторах среды.

Часто потребности видов в одних веществах оцениваются по известным потребностям в других с использованием стехиометрических отношений элементов в среде или в клетках; считается, что эти отношения постоянны. Например, для океанического фитопланктона приводится атомарное отношение элементов O:C:Si:N:P = 212:106:20:15:1 (Sverdrup, Johnson et al., 1942). Однако в последнее время установлено, что благодаря способности фитопланктона создавать внутриклеточные запасы биогенных элементов, а также благодаря механизмам перестройки биохимического состава клеток при изменении условий их функционирования отношение веществ в клетках может варьировать. Так, С.Э.Йоргенсен (JØ rgensen, 1979) для озерных сообществ микроводорослей приводит диапазон отношений азота к фосфору от 4.1 до 291. При помощи непосредственных авторадиографических методов обнаружено, что отношение внутриклеточных запасов углерода к запасам фосфора меняется у пресноводного фитопланктона от 3.3 до 500 (Gutelmacher, Petrova, 1982).

Количество вещества l, расходуемое любой клеткой при делении, и количество того же биогена q, содержащееся во вновь образованных клетках, связаны соотношением l=q+m, где m — количество биогена, выделяемое одной клеткой в среду при делении и в результате обмена веществ.

Содержание вещества q в клетках в течение стадии B определяется не только веществом l_B, потребляемым из среды, но и долей биогена, доставшейся от материнской клетки:

В течение стадии B не меняется количество вещества l_B, потребляемое из среды в расчете на одну вновь образованную клетку, и постоянно падает концентрация потребляемого биогена. На стадии C не изменяется пороговое значение биогена (как правило, близкое к нулю) и уменьшается содержание биогена в клетке. Динамика содержания вещества в клетке, фактически представляющая собой альтернативное рис. 1.1 описание существования стадий процесса “потребление — рост”, приведена на рис. 1.3.

Эмпирическое соотношение (порою q_A >> q_B) отражает тот факт, что длительность стадии A связана с некоторыми факторами, тормозящими возможность деления клеток, но не с недостатком питательного вещества в клетках.

Анализ процесса “потребление-рост” показывает, что со сменой стадий происходит закономерное изменение самих потребностей: на стадии A вещество накапливается в клетках; при этом квота изменяется от начальной (q_н) до максимальной (q_мк). Во время стадии B потребление вещества из среды в расчете на одну клетку или единицу биомассы остается постоянным. Эта величина носит название квоты деления (q_д). Как правило, q_д меньше q_мк. Это означает, что отсутствие клеточного деления на стадии A не связано с недостаточным для генерации роста внутриклеточным содержанием биогенного элемента. На стадии C квота постепенно уменьшается, и рост культуры останавливается по достижении минимальной квоты (q_мн).

Более показательным и сравнительно простым способом является определение квоты не прямым, а косвенным путем (Dauta, Brunel et al., 1982; Ревкова, 1987; Левич, Артюхова, 1991). Реально измеряются убыль биогенного элемента из среды и прирост биомассы культуры за тот же отрезок времени. Квоты рассчитываются на основании закона о сохранении вещества: убыль вещества из среды принимается равной его потреблению клетками. Для определения начальной и минимальной квот необходимо довести культуру до стационарной фазы роста при двух различных исходных концентрациях ресурсов в среде:

b_н q_н + DL₁ = b_{1 к} q_мн;

b_н q_н + DL₂ = b_{2 к} q_мн,

Обычно одну из двух исходных концентраций (пусть L₁) выбирают нулевой. Тогда

На стадии B, как отмечалось, отношение потребленного биогенного элемента к величине приросшей биомассы постоянно. Это отношение названо выше квотой деления и рассчитывается по измеренным в опыте на стадии B значениям DL и Db:

можно сравнить с потребностью q_д лишь при L >> b_н q_н и при b>> b_н. Таким образом, о величинах q_д и q_мн, называя их квотами, правильнее говорить как о количествах вещества, поглощенного из среды, а не содержащегося внутри клеток.

Водоросли выращивали в колбах объемом 0.5 л в люминостате при круглосуточном освещении лампами дневного света 3.7 Вт/м² и t=27-28° C при начальной кислотности среды 7.5-7.8.

В течение всех опытов длительностью 1-2 мес определяли численность клеток водорослей прямым счетом в камере Нажотта или нефелометрически. Концентрацию нитратов в среде измеряли с помощью ионоселективных электродов, концентрацию фосфатов — колориметрическим методом с использованием молибдата аммония и хлористого олова (более подробное описание методов см. 2.2) в среднем 2 раза в неделю (в начале опыта чаще, в конце опыта реже). Количество потребленного клетками водорослей биогенного элемента определяли по убыли его из среды. Биомассу определяли весовым методом по сырой массе. Определенный объем суспензии водорослей известной численности отфильтровывали через мембранный фильтр. Биомассу клеток определяли по разнице между массой фильтра с осажденными на нем клетками и массой чистого фильтра, через который предварительно пропускали дистиллированную воду, и пересчитывали на одну клетку. Относительная ошибка измерения биомассы, определенная по 10 повторностям, составила около 10%.

Методика определения квот проиллюстрирована на материале анализа опыта с культурой Chlorella ellipsoidea. Для всех исследованных видов найденные величины квот сведены в табл.1.1 и 1.2 (Левич, Артюхова, 1991).

Для водоросли Ch. ellipsoidea исследовали сочетания концентраций азота и фосфора с изменением их соотношения N:P от 0.4 до 80. Для остальных водорослей в дальнейшем изучен размах этих отношений от 0.5 до 200. Изученные концентрации азота и фосфора представлены на рис. 1.4.

На рис. 1.5 приведены различные варианты ПР-кривых для Ch. ellipsoidea. В большинстве случаев это типичные кривые с тремя стадиями развития культуры А, В и С. В ряде случаев отсутствовали стадия А или В. Для всех исследованных нами водорослей стадия А присутствовала в 68 случаях из 136, а стадия В — в 78.

По полученным данным о численности и поглощенном веществе отдельно для азота и фосфора рассчитаны клеточные квоты: квота максимальная — q_мк; квота деления — q_д и квота минимальная — q_мн. Квоты, соответствующие трем стадиям развития культуры, приведены в табл. 1.2. Величины q_мк как по фосфору, так и по азоту варьируют в широких пределах: q^P_мк от 1 до 4´ 10^-9 мг/кл, q^N_мк от 1.5 до 56.6´ 10^-9 мг/кл. Эта величина не является стабильной характеристикой вида и может зависеть от различных факторов, в частности, от исходного состояния культуры, среды, условий выращивания и т.д.

Для четырех видов зеленых водорослей была оценена (Артюхова и др., 1988) линейная регрессия зависимости потребностей клеток от концентрации азота (в диапазоне от 10 до 60 мг/л), фосфора (в диапазоне от 0 до 5 мг/л) и от освещенности (0.15, 0.75 и 2.9 Вт/м²). Оказалось, что изменчивость потребностей, по-видимому, определяется не столько изменениями уровней факторов, сколько сменой стадии развития культур. Зависимость же квоты деления и минимальной квоты от начальных концентраций биогенов в пределах ошибок опыта отсутствует, а от освещенности — незначительна.

Фосфор лимитировал развитие лишь в двух случаях при отношениях начального содержания азота к фосфору, равных 80 и 43. Действительно, в этих случаях клеточные квоты по фосфору имели наименьшие значения 0.03 и 0.05´ 10^-9 мг/кл. Значения же q^N_мн по азоту в этих случаях были наибольшими из всех q^N_мн, что еще раз подтверждает лимитирование роста в этих двух вариантах фосфором. Таким образом, определяем q^P_мн = =0.04´ 10^-9 мг/кл.

В большинстве случаев для Ch.ellipsoidea лимитирующим фактором развития был азот. Для этих случаев найдено среднее значение минимальных клеточных квот по азоту q^N_мн= 1.5´ 10^-9 мг/кл.

В двух вариантах при N₀ = 32 и 44 мг/л и P₀ = 2.25 мг/л развитие лимитировалось светом. Действительно, значения клеточных квот на стадии C в этих случаях не были минимальными ни по азоту, ни по фосфору.

В предварительных методических опытах (в 10 повторностях) было установлено, что при доверительной вероятности 90% ошибки определения численностей составляют 8%, биомассы — 10%, нитратов — 7%, фосфатов — 10%. Следовательно, ошибки определения клеточных квот, вызванные ошибками исходных данных, составляют около 20-30%. В табл. 1.2 приведены погрешности клеточных квот, равные ошибке усреднения по тем вариантам опыта, в которых, согласно анализу условий опыта, данная квота воспроизводилась.

В табл. 1.3 приведены конкретные значения квот по азоту и фосфору для большой группы видов микроводорослей, изучавшихся в лаборатории при накопительном режиме культивирования. Большинство исследованных видов принадлежит к отделу зеленых водорослей, за исключением двух видов сине-зеленых Anabaena variabilis и Anacystis nidulans. В таблице не представлены начальные квоты, поскольку они зависят от внешних условий среды, в которой содержалась популяция перед началом накопительного эксперимента, и поэтому могут сильно варьировать. Квоты других типов не зависят от исходной обогащенности популяции биогенными элементами. Однако из табл. 1.3 видно, что в различных экспериментах величины квот меняются. Следует отметить, что начальные абсолютные концентрации азота и фосфора в среде для культивирования не влияют на величины квот. Поэтому разброс в значениях может быть связан, например, с разным физиологическим состоянием фитопланктона, вызванным сменой времен года. В таблице также приведены величины максимальных и конечных квот для Scenedesmus quadricauda, почерпнутые из литературных источников. Приведенные здесь данные помогают составить представление о вариабельности и различии потребностей видов в биогенных элементах. Однако измеренные разными исследователями в различные периоды времени (Ревкова и др., 1985; Левич и др., 1986б; Артюхова и др., 1988; и др.) клеточные квоты, приведенные в этой таблице, являются в большей степени информацией о порядке величин, чем окончательными значениями, так как методы их измерения варьировали от опыта к опыту из-за различных целей экспериментов. Кроме того, сама тема разработана очень мало и остается открытой как в концептуальном, так и в методическом плане. Материалы, приведенные в табл. 1.3, могут, на наш взгляд, послужить начальной информацией при постановке новых экспериментов по измерению квот.

Таким образом, эффективность фотосинтетического процесса и эффективность утилизации световой энергии зависят от клеточного объема. Поэтому предлагается (Булгаков, 1990), установив потребление световой энергии пропорциональным углеродной продукции, называть потребностью в свете клетки величину q^E, прямо пропорциональную квадратному корню из клеточного объема (световая квота на единицу биомассы в этом случае обратно пропорциональна квадратному корню из клеточного объема).

Справедливость такого подхода к измерению энергетических потребностей проверяли путем составления балансовых уравнений светопотребления для поликультур водорослей. Использовали данные двух накопительных опытов. В первом из них совместно выращивались Scenedesmus quadricauda и Scenedesmus obliquus на трех средах с одинаковым исходным содержанием фосфора 4.5 мг/л. Концентрации азота составили 10.5, 35 и 110 мг/л. Опыт продолжался 82 сут. В результате в конце опыта наблюдали очень высокую плотность клеток, которая могла быть вероятной причиной недостатка света. Во втором опыте поликультура состояла из Scenedesmus quadricauda и Ankistrodesmus falсatus, выращивавшихся на трех средах (N — 14 мг/л, P — 3.1 мг/л; N — 34 мг/л, P — 0.6 мг/л; N — 34 мг/л, P — 0.1 мг/л). Так же как и в первом опыте, высокая продолжительность роста поликультуры (56 сут.) привела к значительному самозатенению клеток. Путем сравнения отношений квот по азоту и фосфору для каждого вида и отношения суммарных потреблений этих элементов поликультурой было показано, что остановка роста культуры объясняется не только субстратным лимитированием, но и недостатком других ресурсов (в данном случае — света). Были построены балансовые равенства распределения как азота и фосфора, так и световой энергии между двумя видами:

где q^N, q^P и q^E, - квоты соответственно по азоту, фосфору и свету на единицу биомассы, измеренные в поликультурах ; Db₁ и Db₂ — приросты биомассы для каждого вида за счет внешней среды за все время опыта.

В правой части равенств (1-3) стоит общее потребление ресурса поликультурой. DN и DP находим из опыта, а величину DE вычисляем по формуле

где V_ср — средний размер клеток поликультуры, равный Db/Dn;

Db — общий прирост биомассы поликультуры за счет cреды;

Dn — соответствующий прирост численности;

Показано, что на средах с заданным отношением биогенных элементов преимущество получают те виды микроводорослей, у которых отношение минимальных квот близко к отношению концентраций элементов в среде. Получение количественных оценок потребностей различных видов, таким образом, позволяет перейти к направленному поиску состава сред для получения сообществ с заданными свойствами. Следовательно, знания о величинах клеточных квот необходимы для управления структурой альгоценозов.